支原体是细胞培养物的常见和严重污染物。已显示  30%-87%的细胞培养物感染支原体。许多支原体污染，特别是在连续细胞系中，生长缓慢，不破坏宿主细胞，但仍能够影响各种参数，导致结果不可靠或错误。这些影响包括代谢、生长、活力、DNA、RNA和蛋白质合成以及形态的变化。支原体检测是确保准确研究和可靠生物技术产品的必要质量控制工具。

e-Myco™（版本2.0）产品是一组引物，旨在检测是否存在可能污染生物材料（如培养细胞）的支原体。常规

• e-Myco™支原体PCR预混液：PCR条中的蓝色沉淀
• 对照DNA：无色透明液体
• 去DNase/RNase水：无色透明液体

No 目录 组成 25235 25236

• 随着时间的推移，PCR抑制物质可能在细胞培养基中蓄积。
• 血清超过10 ~ 12%的培养基对PCR等下游应用有抑制作用。而且，细胞培养基中的常规材料酚红很可能发生交叉反应，从而干扰PCR中的信号。
• 这些负面影响可以通过使用Myco-Spin支原体提取试剂盒进行样品制备来克服。
• 为此，建议纯粹从样本中分离基因组DNA，以确保分析的准确性和重复性。

1. 制备200 μL细胞培养材料，然后转移至新的1.5 mL微管中
2. 向样品管中加入200 μL Buffer ML1，20 μL Proteinase K和5 μL RNase ASolution
    

用于检测支原体的技术涉及在选择性培养基上培养样品，

这需要至少1周才能获得结果，而通过用该引物组进行PCR，这是基于保守的16S rRNA，在数小时内获得检测结果。再者，如果你想知道详细的物种，你可以从你设计的引物进行PCR和测序。采用的8-甲氧基补骨脂素(8-MOP)用于消除污染DNA的模板活性。已知8-MOP在波长320-400 nm入射光光光活化后嵌入双链核酸，形成共价链间交联。构建该产品的内部对照以识别假阴性  结果  in  每个  反应。以下  内部  设计对照  in  此类  a  方式   的

e-Myco™

1 支原体PCR预混物

3 不含DNase/RNase

水

< 0.01%热启动Taq DNA聚合酶

< 0.01%dATP、dTTP、dGTP、dCTP

< 0.005%支原体引物，内部对照

< 0.001%8-MOP（溶于DMSO）

从猪鼻支原体污染的培养人细胞中提取的基因组DNA < 0.01%。

无模板对照

< 去DNase/RNase水

48T 8T

25 μL x 3T 25 μL x 1T

并通过倒置或移液充分混合。

3. 将裂解物在56 ℃（预热的加热块或水浴）下孵育10 min。
4. *裂解后，向上层样品管中加入200 μL Buffer ML2，充分混匀。
5. 向裂解液中加入200 μL无水乙醇，轻轻颠倒5-6次或吸液混匀。请勿涡旋。混合后，短暂离心1.5 mL试管，除去盖子内部的液滴。

样本引物对用于扩增内部对照和靶DNA，通过大小进行区分。e-Myco™支原体PCR检测试剂盒（版本2.0）包含PCR的所有组分，模板除外：i-StarTaqTM DNA聚合酶、dNTP、10x缓冲液、引物、8-MOP和支原体部分基因扩增的内部对照。因此，您可以添加模板并进行PCR反应。

• 预混型：该e-Myco™支原体PCR检测试剂盒（版本2.0）包含PCR反应的所有组分。您只需添加模板DNA或样本。
• 广义种属检测：您可以检测五种常见的细胞培养-感染支原体以及其他各种支原体
• 菌种确定：您可以通过对扩增的PCR产物进行测序来确定支原体的菌种。
• 内部对照品：产品中嵌入的外源性内部阳性对照品可防止可能由错误PCR检测引起的误判。
• 消除残留污染系统：8-MOP溶液可防止PCR产物的残留污染。
• 仅供研究使用，不用于诊断程序。

e-Myco™支原体PCR检测试剂盒（版本2.0）的开发、设计和销售仅供研究使用。预期不用于人类或动物疾病诊断。不得在人或动物体内或体外使用。在将其用于其他目的之前，用户必须按照适用法律、指令和法规确认系统。

• 移液器和移液器吸头（气溶胶屏障）•Myco-Spin支原体提取试剂盒
• 热循环仪 •涡旋混合器
• 一次性手套 •加热块

• 保存条件：接收后-22~-18 ℃保存。
• 有效期：e-Myco™支原体PCR检测试剂盒（版本2.0）在适当的储存条件下可储存长达12个月，性能和质量均未降低。产品包装盒上标有失效日期。

6. 在不润湿边缘的情况下，小心将全部裂解物转移至旋转柱（2 mL收集管中），盖上盖子，并以13,000 rpm离心1 min。弃去滤液，将旋转柱置于2 mL收集管中（重复使用）。
7. 向色谱柱中加入700 μL缓冲液MWA，并以13,000 rpm离心1 min。
8. 在不润湿边缘的情况下，向色谱柱中加入700 μL缓冲液MWB，并以13,000 rpm离心1 min。弃去流穿液，将色谱柱置于2.0 mL采集管中（重复使用），然后再次离心1 min以干燥膜。*丢弃穿柱管和收集管。
9. 将旋转柱置于新的1.5 mL试管（未提供）中，并将50 μL缓冲液ME直接置于膜上。在室温下孵育1 min，然后以13,000 rpm离心1 min以洗脱。

1. 在1.5 mL试管中制备供试细胞培养物的细胞悬液。然后用一般计数方法计数细胞数。每次检测至少需要5 x 104个细胞。

注：强支原体感染只需10 ~ 100个细胞即可检出，而弱感染需要5000 ~ 50000个细胞以上的细胞。您可以根据您怀疑的感染率稀释模板。我们建议您在制备直接上清液的系列稀释液后进行PCR反应，以获得结果。

2. 将计数的细胞（超过5 × 104个细胞）转移至1.5 mL试管中。在微量离心机中旋转10-15秒。小心倒出上清液。
3. 将细胞重悬于1 mL无菌PBS或DPBS溶液中进行清洗。
4. 在微量离心机中旋转10-15秒。小心倒出上清液。

[选项]再次重复该清洗步骤。

5. 将细胞沉淀重悬于100 μL无菌PBS或DPBS溶液中。

注：如果您希望获得结果，使用PBS溶液优于Tris(10 mM，pH 8.5)、TE(10 mM Tris，0.1 mM EDTA)或高压灭菌DW。

6. 在95 ℃下加热样品10 min，涡旋5-10 s。然后，使用台式离心机（室温）以13,000 rpm离心2 min。
7. 将一等份加热上清液转移至新试管中。该上清液将用作PCR的模板。